Diabetologia：激活但功能受损的潜意识Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次再次出现人微内自身肝细胞到再次出现1型式肾病针灸症状的令人满意率在幼儿时期就有比较好的阐述，多个人微内自身肝细胞无症状的幼儿中的有70%在血清转换后10月内患上肾病，而随访15年的幼儿这一%降低到84%。相较之下，占有针灸1型式肾病一半以上的型式1型式肾病的发作机制还没想得到合理的分析。

越来越多的人开始用于分段系统来定义1型式肾病的令人满意：个微在再次出现多种人微内自身肝细胞时转到第1之前，再次出现血糖异常时转到第2之前，再次出现症状时转到第3之前。一些多发人微内自身肝细胞无症状的个微，在1期和2期，令人满意较快，并工业发展为发作的1型式肾病。我们之前阐述了一四组在首次验证到多种人微内自身肝细胞抽取后有数10年无肾病的近于快令人满意者，这四组病人人数不算，但外观上非常说明。随后，我们发现人微内自身肝细胞甲基化CD8+T蛋白质反其所在令人满意快速的病人中的基本不存在，但在近期发作和长年存在的肾病病人中的很容易验证到。这可能表明，与令人满意病人相较，这些病人自身免疫反其所的抑制减快。

晚期分析表明，尽管抑制性T蛋白质(Treg)量正常，但肾病病人存在一些新功能缺陷，其中的仅限于对IL-2的反其所能力降低。此外，肾病病人中的的效其所CD4+T蛋白质可能对抑制不具抵抗性，表现为效其所T蛋白质的抑止减慢，自然转化成的Treg和游离转化成的诱导Treg，以及肝细胞经历的CD4+T蛋白质中的IL-2反其所减慢。本分析的目的是阐述了CD4+抑制性T蛋白质(Treg)在一小群近于快速令人满意者中的的外观上，他们的年长为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

新方法：BOX分析是一项以人群相结合的斜向分析，在21岁此表复发的病人亲属中的检查1型式肾病的危险因素。我们之前阐述了长年快速令人满意者的外观上，他们保持多重人微内自身肝细胞无症状超过10年，但没再次出现肾病的针灸症状，快性或非来进行性自身免疫。随后，10名继续保持无肾病并希望共享大量血液循环抽取的快速令人满意者纳入T和B蛋白质新功能归纳。在现今的分析中的，8名快令人满意者(SP四组)，中的位年龄43岁(31-72岁)，18 - 32岁密切关系的人微内自身肝细胞无症状。所有的大多数人都始终保持1型式肾病令人满意的1期，尽管一些人随后失去了人微内自身肝细胞对某些肝细胞的无症状反其所，然而，一名病人早已始终保持2期有数6年，但没再次出现针灸症状，一名病人被诊断为肾病，该病人72岁，在采集实验抽取时，其HbA1c上升时到53 mmol/mol(7%)，在数据归纳中的对该遗传物质来进行了直接分析。转化外周血单个核蛋白质(PBMCs)，采用多参数流式蛋白质忍术和T蛋白质抑止试制分析遗传物质中的Treg的高频率、甲基化和新功能。用于FlowSOM和CITRUS(聚类深入研究、表征和回归)来进行无监督聚类归纳，分析Treg甲基化。

结果：与卫生遗传物质相较，来自快令人满意微的思绪CD4+T蛋白质的监督聚类结果显示，触发的思绪CD4+ Treg高频率降低，与糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)传达降低有关。一名HbA1c上升时的病人与令人满意快速者和也就是说的对照四组相较，Treg谱有所相同。新功能归纳表明，与卫生遗传物质相较，来自快速令人满意微的Treg内源性的CD4+效其所T蛋白质抑止引人注意损伤。表现为对效其所CD4+T蛋白质CD25和CD134传达的抑止降低。

平面图1 深入的甲基化归纳结果显示，CD4+Treg亚型式在快令人满意函数调用中的降低。由FlowSOM分解成的Treg室，挤满在来自所有遗传物质的活CD4+CD45RA -蛋白质上。根据上标物传达深入研究出10个元簇:思绪T蛋白质_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;思绪T cell_4;CD49b思绪T蛋白质;HLA-DR + GITR +思绪T蛋白质;内核Treg_1;内核Treg_2;内核Treg_3;和内核Treg_4。(a)用于9个相同Treg上标分解成的10个元簇的MST。每个数据流代表一个坦克部队(100个坦克部队)，更大的元坦克部队(10个元坦克部队)在数据流四组周围制做。每个数据流中的的点心平面图指出单个上标的传达档次。(b)每个元聚类的热平面图，以结果显示全面性上标传达。(c, d)为HD四组(c)和SP四组(d)分解成平面图，以及FlowSOM比对的每个元簇的覆盖层。(e-l)相比较重元素为每个metacluster箱终点站平面图(重元素> 0.05%)确定为HD和SP四组:内核Treg_2 (e),内核Treg_3 (f),内核Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +思绪T蛋白质(h)、思绪T cell_1(i),思绪T cell_2 (j),思绪T cell_3 (k) n d CD49b思绪T蛋白质(l)。绿色格三子代表理其所SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon筛选小写字母秩检验。此键适用于平面图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

平面图2 用于CITRUS的实测属实，Treg高频率的降低是令人满意快速的标志。这两项奈斯(a - f)和柑橘归纳(g-k)比起SP大多数人和也就是说的HD大多数人在CD4+CD45RA−T蛋白质上的差异。(a)特异性CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群微的标志性平面图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3硫化物，然后通过HLA-DR和GITR传达来进行转化，各种类型FlowSOM群微。(b) HD(黑点)和SP(蓝点)四组以及遗传物质SP 606(绿色)中的CD25+ cd127的高频率摘要平面图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+奈斯三子集的箱终点站平面图;(c) HLA-DRloGITR−(内核Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(内核Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(内核Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+内核T cell)。(g - i)柑桔簇螺旋由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3传达强度着色，记号突出的簇被比对为SP和HD函数调用密切关系的相同。(j)箱终点站平面图结果显示了在SP(蓝点)和HD(灰点)四组中的，CITRUS思绪Treg_3和Treg_4的相比较重元素(%)。(k)直方平面图结果显示每个簇的甲基化(粉红色)和Treg上标相比较传达与故事情节传达(橙色);上列，内核Treg_3;下面恰巧，内核Treg_4。故事情节与所有其他簇中的上标的传达有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon筛选小写字母秩检验

平面图3 与卫生献血者相较，令人满意快速者思绪treg的GITR降低。每个思绪CD4+T蛋白质元簇(思绪T蛋白质_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;CD49b +思绪T蛋白质;HLA-DR + GITR +思绪T蛋白质;内核Treg_2;内核Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)验证每个传达上标的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)函数调用的传达热平面图(sp606不仅限于在内)。(c,d)思绪Treg_4元簇中的所有HD(灰色)、所有SP(橙色)和SP 606(绿色)的FlowSOM GITR传达串接，结果显示直方平面图(c)和摘要平面图(d)。Wilcoxon筛选小写字母秩和检验，p< 0.07(绿色)所有遗传物质仅限于，p< 0.05(橙色)遗传物质SP 606和也就是说的HD不仅限于在测试中的。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs中的GITR传达，从这两项奈斯，从所有HD(灰色)、所有SP(橙色)和SP 606(绿色)串接，结果显示直方平面图(e)和摘要平面图(f) *p< 0.05, Wilcoxon筛选小写字母秩检验

平面图4 来自快速令人满意的CD4+ treg蛋白质控制效其所CD4+T蛋白质的能力降低。SP四组用橙色的终点站和格三子指出，HD四组用黑色的终点站和格三子指出，绿色的终点站/格三子指出遗传物质sp606。用于CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T蛋白质来进行分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被上标为CFSE, Treg按掩蔽的%滴定。用抗CD3 /28微珠触发蛋白质，养成3在此之后来进行流式蛋白质忍术验证。(a-d)与CD4+反之亦然者相比较其所的treg养成(自微)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD反之亦然者养成。(a,b,f) CFSE细胞分裂(a,e)和CFSE抑止百分比(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的抑止百分比。用于无症状对照(触发的积近于响其所蛋白质仅有treg)计算抑止百分比。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差归纳。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比起测试

平面图5 效其所CD4+T蛋白质对快速令人满意的T蛋白质触发的抑止更敏感。SP四组用橙色的终点站和格三子指出，HD四组用黑色的终点站和格三子指出，绿色的终点站/格三子指出遗传物质sp606。用于CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T蛋白质来进行分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被cfsel上标，treg按掩蔽的%滴定。用抗CD3 /28微珠触发蛋白质，养成3在此之后来进行流式蛋白质忍术(CD25反染)和蛋白质因三子归纳。HD Treg与HD、SP或sp606反之亦然者一同养成。(a,b) CFSE细胞分裂(a)和CFSE抑止花红(b)。(c,d) CD25抑止花红(c)和CD134抑止花红(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共养成中的的传达。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差归纳。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比起测试

论证：我们结论的论证是，来自快速令人满意三子的触发思绪CD4+Treg在GITR传达中的想得到了适配和丰富，强调了进一步分析Treg在1型式肾病可能会个微中的的异质性的必要性。

原意说是：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28